Морфологические проявления мочекаменной болезни

Термин хроническая болезнь почек (ХБП) появился в 2002 году, когда официально был опубликован новый раздел Рекомендаций DOQI (Dialysis Outcome Quality Initiative), названный Рекомендациями по хроническим болезням почек [1]. У каждого десятого жителя Земли отмечаются признаки ХБП [2]. На ранних стадиях болезнь диагностируется лишь у 1% населения. Согласно результатам крупного исследования NEORICA, проводимом в Великобритании, среди 40 097 200 обследованных жителей страны в возрасте старше 18 лет ХБП 3-5-й стадий выявлена у 3 547 654 человек, что составляет 8,8%. Ежегодный прирост диализной ХПН (5-я стадия ХБП) составляет 100-150 человек на 1 млн. населения. По мнению ряда исследователей, наблюдающийся в настоящее время прогрессивный рост числа пациентов с терминальной ХПН приобретает характер пандемии [4].

Анализ данных литературы показал, что большинство работ посвящено изучению ХБП при таких заболеваниях, как гломерулонефрит, сахарный диабет, гипертоническая болезнь, атеросклероз и т.д., что даже обозначено в литературе термином «кардиоренальный континуум». При этом работ, посвященных изучению ХБП при МКБ, практически нет, тогда как МКБ в настоящее время является одним из самых распространённых урологических заболеваний и составляет в развитых странах от 0,5 до 5,3 %. В России на долю МКБ приходится до 38,2% всех урологических больных, наиболее часто данная патология поражает людей в самый активный период их жизни – 20-50 лет, что, несомненно, представляет огромную экономическую проблему современного здравоохранения. В настоящее время ХБП изучается с позиций клинико-лабораторной диагностики, тогда как морфологические работы практически отсутствуют.

Цель исследования: оптимизация морфологической диагностики ХБП, обусловленной МКБ, в различные стадии ее развития, и установление критериев раннего повреждения паренхимы и стромы почек на доклиническом этапе.

Материал и методы

Материалом для исследования послужил послеоперационный материал, полученный от 154 больных, находившихся на стационарном лечении по поводу мочекаменной болезни в период с 2005 по 2010 годы в ГКБ № 3 им. С.Р. Миротворцева ГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России.

Средний возраст больных составил 47,1 года. Количество мужчин – 63 (40,1%), женщин – 91 (59,9%).

Диагноз МКБ устанавливали на основании данных анамнеза, субъективных и объективных клинических признаков, результатов УЗИ, других инструментальных и лабораторных методов исследований.

Стадию ХБП определяли по уровню скорости клубочковой фильтрации (СКФ) согласно последним рекомендациям NKF-K/DOQI (2005). СКФ подсчитывали с использованием формулы Кокрофта-Голта, в которой учитывается уровень креатинина сыворотки крови, возраст и масса тела пациента.

По результатам подсчета СКФ согласно последним рекомендациям NKF-K/DOQI (2005) все пациенты были разделены на 5 групп. В качестве контроля использовали секционный материал, полученный во время проведения судебно-медицинской экспертизы 30 лиц, умерших от заболеваний, не связанных с патологией почек. Возраст группы контроля составил 31-52 года (Ме=44,0).

Послеоперационный или биопсийный материал для гистологического исследования фиксировали в 10%-м нейтральном формалине, обезвоживали в ацетон-ксилоловой батарее и заливали в парафин. После депарафинизации срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином-эозином для обзорного гистологического изучения. Для оценки степени разрастания соединительной ткани – пикрофуксиновой смесью по методу Ван-Гизон и трихромом по Массону, для выявления признаков дезорганизации соединительной ткани использовали гистохимический метод ОКГ (оранжевый Ж, кислотный красный, водный голубой).

При проведении стандартного гистологического исследования оценивали клубочковый аппарат и состояние тубулоинтерстициальной зоны с использованием определенного алгоритма изучения нефробиоптата. Для определения размеров объектов использовали окуляр-микрометр, сетку Автандилова (Автандилов Г.Г., 1994), а также морфометрическую систему Bio Vision и автоматизированную систему подсчета морфологических изменений ARIOL (США). Морфометрическое исследование выполняли в 30 полях зрения.

Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием моноклональных мышиных антител к сосудисто-эндотелиальному фактору роста, рецепторам EGFR, к семейству цитокератинов: 8, 5/6, 34βЕ, 10/13. Пролиферативную активность эпителиоцитов канальцев почек изучали иммуногистохимическим методом с применением моноклональных мышиных антител к Ki-67, а также с помощью выявления антигена ядра пролиферирующей клетки PCNA. Теорию эпителиально-мезенхимальной трансформации клеток эпителия канальцев почек проверяли с использованием Е-кадгерина.

Для обработки данных был использован пакет прикладных статистических программ Bio 5.8.4.3 версия 2009 (AnalystSoft® Inc.) и ISTICA 10.0 (Soft® Inc.). Предварительная статистическая обработка данных заключалась в проверке соответствия формы распределения количественных признаков нормальному, для чего использовали критерий Шапиро-Уилка, а также равенства генеральных дисперсий с помощью F-критерия Фишера. Проверку гипотезы о равенстве генеральных средних во всех случаях проводили с помощью H-критерия Краскела-Уоллиса для оценки различий нескольких независимых групп. Нулевую гипотезу отвергали в случае p < 0,05. Парное межгрупповое сравнение проводили с использованием Q-критерия Данна. Исследование взаимосвязи между количественными признаками осуществляли при помощи парного коэффициента линейной корреляции Спирмена. Значимость морфометрических показателей выявляли с помощью дискриминантного анализа с измерением уровня лямбды Уилкса. Для каждого показателя в исследуемых группах вычисляли такие значения, как медиана (Ме), мода (Мо), минимум и максимум значений, межквартильный размах.

Результаты

Сопоставление клинико-лабораторных и морфометрических показателей почек при различных стадиях ХБП позволило обозначить ряд новых закономерностей прогрессирования ХБП (табл.1).

Так к морфологическим признакам ранних стадий ХБП можно отнести: выраженное утолщение стенки артерий, уменьшение диаметра проксимальных и дистальных извитых канальцев, появление очаговой лимфогистиоцитарной инфильтрации, а также разрастание в интерстициальной зоне нежно-волокнистой соединительной ткани. Подобные изменения были обнаружены нами при исследовании биоптатов пациентов с 1 и 2 стадией ХБП.

Что же касается более поздних стадий ХБП, то они, к сожалению, имеют менее важное значение в прогностическом плане, однако именно морфологические проявления, развивающиеся на поздних стадиях, наиболее ярко демонстрируют ведущую роль изменений тубулоинтерстициальной зоны в механизме развития ХБП. Так, если размер клубочков в 5-й стадии по сравнению с 1-й уменьшался в среднем в 2,7-3,1 раза, то диаметр канальцев – в 5 раз. Следует отметить, что статистически значимое уменьшение размеров клубочков стали регистрировать лишь с 3-й стадии, когда в почке стали развиваться необратимые процессы.

Во 2-ю стадию ХБП в канальцах почек развиваются компенсаторно-приспособительные процессы в виде выраженного увеличения размеров эпителиоцитов в 1,5 раза и пролиферации эпителия канальцев.

Факт пролиферативной активности эпителиоцитов подтвержден нами и при проведении иммуногистохимического исследования с антигеном пролиферирующего клеточного ядра (PCNA), который является мультифункциональным белком и экспрессируется в делящихся клетках. Площадь экспрессии в биопсийном материале почки пациентов 2-й группы достигала 84% , в то время как в 1-й группе данный показатель соответствовал 7,8%, в 3-й группе – 7%, в 4-й – 3,5%.

Одной из теорий, объясняющих развитие тубулоинтерстициальных изменений, является теория эпителиально-мезенхимальной трансформации (ЭМТ) клеток. Считается, что эпителиоциты теряют свою эпителиальную дифференцировку и начинают экспрессировать мезенхимальные факторы, которые способствуют развитию склеротических изменений. В нашем исследовании мы попытались определить наличие факта эпителиально-мезенхимальной трансформации клеток по результатам определения уровня экспрессии Е-кадгерина, так как согласно данным ряда авторов именно потеря Е-кадгерина свидетельствует о начале процесса ЭМТ [5,6].

Проведено иммуногистохимическое исследование с набором цитокератинов (34βЕ, 10/13, 5/6 и 8), выявляющих эпителиальные клетки, а также Е-кадгерином. Согласно теории ЭМТ, мы должны были получить максимальный уровень экспрессии на первых двух стадиях и минимальный – в последних стадиях ХБП, чего не было в нашем исследовании. Во всех группах наблюдения отмечена ярко выраженная реакция, по результатам подсчета histochemical score соответствующая положительной реакции и определенная нами как +++. При дальнейшем проведении иммуногистохимического исследования мы получили достоверные данные, подтверждающие, что при прогрессировании ХБП в эпителиоцитах канальцев почек снижается экспрессия Е-кадгерина. Согласно результатам данного исследования, снижение экспрессии происходит постепенно от 2-й стадии до отрицательных результатов в 4-й и 5-й стадиях ХБП, что подтверждено получением статистически значимого уровня p=0,021. При этом снижение экспрессии антигена происходило именно в эпителиоцитах, уменьшенных в размерах, приобретающих вытянутую, веретенообразную форму уже со 2-й стадии ХБП, что свидетельствовало об исчезновении в них фенотипических признаков эпителиальной ткани. Мы считаем это морфологическим проявлением нарушения нормальной последовательности развития репаративных процессов: пролиферация – дифференцировка. И если во второй стадии мы регистрировали признаки компенсаторно-приспособительных процессов, то начиная с третьей стадии, морфологические изменения свидетельствовали о нарушении процесса дифференцировки клеток (что подтверждало исчезновение Е-кадгерина), и начиналось развитие склеротических процессов, что можно считать началом необратимости хронической болезни почек.

Таким образом, полученные в результате исследования данные подтвердили стадийность изменений не только клинико-лабораторных показателей, но и морфологической картины в различные стадии ХБП; позволили выявить морфологические критерии каждой из стадий ХБП, в том числе и на первых стадиях развития заболевания, а также установить возможность развития компенсаторно-приспособительных процессов в почке во вторую стадию с последующим формированием необратимого нефросклероза.

Проведенное исследование выявило наличие корреляционной связи разного направления и силы между клинико-лабораторными и морфометрическими показателями как тубуло-интерстициальных компонентов, так и клубочков. Следует отметить, что, снижение СКФ происходит задолго до появления морфологических признаков повреждения клубочков. Это подтверждается тем фактом, что статистически значимые различия в морфометрических показателях изменения клубочкового аппарата по сравнению с группой контроля появляются только в 3-й стадии ХБП. При проведении корреляционного анализа установлено, что наиболее выраженную корреляционную связь как с уровнем креатинина и мочевины сыворотки крови, так и со СКФ, а соответственно и со стадией ХБП имеют такие показатели, как размеры длинной и короткой осей клубочка, количество клеток в инфильтратах мозгового и коркового вещества. Умеренную корреляционную связь показали такие параметры, как количество склерозированных клубочков, диаметр извитых канальцев, высота эпителиоцита, а также толщина стенки артерий. В зависимости от стадии ХБП сила и направление корреляционных связей меняется. Наиболее ранними морфометрическими показателями, уже на ранних стадиях реагирующими на изменения уровня креатинина сыворотки крови, являются толщина стенки артерий и количество клеток в лимфо-гистиоцитарных инфильтратах коркового и мозгового вещества. Кроме того, стоит отметить, что по результатам корреляционного анализа до 5-й стадии ХБП диаметр проксимальных канальцев не имеет зависимости от уровня азотемии и СКФ, в отличие от диаметра дистальных канальцев, показывающих умеренную зависимость уже на 2-й стадии ХБП.

Проведя пошаговый дискриминантный анализ со всеми возможными вариантами, была создана оптимальную модель для определения стадии ХБП с использованием морфометрических показателей. Для этого в группу анализируемых признаков были включены все изученные параметры, имеющие значимую корреляционную связь со скоростью клубочковой фильтрации во всех исследуемых группах. Таким образом, в модель для определения скорости клубочковой фильтрации вошли такие параметры, как средний размер длинной и короткой осей клубочка, минимальная высота эпителиоцита, минимальная толщина стенки артерий, максимальное количество клеток в инфильтратах коркового вещества и минимальное количество клеток в инфильтратах мозгового вещества.

Y=0,089X1+0,1085Х2+1,036Х3+0,07Х4+0.049Х5+0,0298Х6-46,86,

где Y – значение скорости клубочковой фильтрации,

X1 – средний размер длинной оси клубочка,

Х2 – средний размер короткой оси клубочка,

Х3 – минимальная высота эпителиоцита,

Х4 – минимальная толщина стенки артерий,

Х5 – максимальное количество клеток в инфильтрате коркового вещества,

Х6 – минимальное количество клеток в инфильтрате мозгового вещества.

По вычисленной формуле на всем базовом материале по каждому случаю было подсчитано значение скорости клубочковой фильтрации и проведено сравнение с показателями клинико-лабораторного обследования больного. Расхождения между полученными результатами были выявлены только в 5-й группе наблюдения, что связано, на наш взгляд, с рубцовым сморщиванием почек. Во всех остальных группах наблюдения сопоставление полученных данных с истинным значением скорости клубочковой фильтрации, рассчитанной с использованием формулы Кокрофта-Голта, отмечается на уровне среднего значения скорости клубочковой фильтрации, что, по нашему мнению, является достаточным для определения стадии ХБП по морфологическим критериям.

Обсуждение

Стоит отметить, что в работах многих исследователей морфологическая картина ХБП описывается с учетом классификации, основанной на степени тубулоинтерстициальных изменений, предложенной В.В. Ставской и С.И.Рябовым (1987), и подразделяющую степень изменений тубулоинтерстициальной зоны на незначительные, умеренные и выраженные, составляющие до 30%, от 30 до 70% и более 70% повреждения тубуло-интерстициального аппарата почки соответственно [3]. В данном исследовании мы также сделали попытку использования данной классификации и пытались разделить группы наблюдения не по результатам клинико-лабораторного исследования, а по степени тубулоинтерстициальных изменений. В дальнейшем при сопоставлении степени изменений тубулоинтерстициальной зоны с данными клинико-лабораторного исследования, мы получили, что 1 группу составили пациенты с 1 стадией ХБП, во 2 группу вошли как пациенты со 2 стадией, так и с 3 стадией ХБП, а в 3 группу вошли пациенты с 3,4 и 5 стадиями ХБП. Таким образом, согласно данной классификации в группу умеренных изменений могут входить одновременно пациенты и с ранней стадией заболевания и с уже доказанной по результатам клинико-лабораторного исследования хронической почечной недостаточностью. А в группу выраженных изменений могут входить пациенты с 3 стадией ХБП и уже с 5 терминальной диализной стадией хронической почечной недостаточности.

Данное обстоятельство послужило поводом отказаться от предложенной классификации, так как подобное разделение не позволяет сопоставить морфологическую картину с клинико-лабораторными показателями при изучении различных стадий ХБП, выявить ранние морфологические изменения, характерные для 1-й стадии развития ХБП, и кроме того мы считаем, что не совсем корректно сравнивать площади поражения в биопсийном материале, представленном столбиком ткани площадью не более квадратного сантиметра и площадью ткани соответствующей удаленной почке.

Заключение

Таким образом, морфологическое и морфометрическое исследования почек показали, что структурные изменения в почке имеют стадийный характер развития и количественные показатели, соответствующие определенной стадии развития ХБП. Выявлена ярко выраженная корреляционная связь различной силы и направления со скоростью клубочковой фильтрации и, соответственно, со стадией ХБП и определенными морфометрическими показателями. Установлено, что морфологическими признаками повреждения почек на ранних стадиях ХБП являются: снижение диаметра как дистальных, так и проксимальных извитых канальцев, выраженное утолщение стенки артерий уже на первой стадии ХБП, появление очаговых лимфогистиоцитарных инфильтратов. Вторая стадия ХБП характеризуется развитием компенсаторно-приспособительных процессов в виде гипертрофии эпителиоцитов и пролиферации канальцевого эпителия, подтвержденной как при обычной окраске, так и при иммуногистохимическом окрашивании. Предложенная математическая модель, основанная на морфометрических показателях, может быть использована для диагностики ранних стадий ХБП.

Источник